INTRODUCCIÓN

H. canis y H. americanum son las dos especies del género Hepatozoon (H) que pueden ser transmitidas al perro a través de sus garrapatas vectoras, Rhipicephalus sanguíneus y Amblyomma maculatum respectivamente. El perro se parasita al ingerir una garrapata con esporozoitos, los que atraviesan la pared del intestino y colonizan distintos órganos; el hígado, el bazo y los ganglios linfáticos en el caso de infección con H. canis, y el músculo cardíaco y esquelético en el caso de infección con H. americanum (Vincent-Johnson et al., 1997; Baneth et al., 2007).

Muchas de las infecciones con H. canis son subclínicas, pero cuando hay signología, la presentación clínica es muy variable y depende, en general, del grado de parasitemia. Los signos, en la mayoría de los pacientes, son leves o moderados, aunque en algunas ocasiones pueden ser severos, especialmente en cachorros o en animales inmunosuprimidos o con enfermedades concurrentes. Los signos clínicos que se observan con mayor frecuencia son mucosas pálidas, caquexia, letargia y fiebre intermitente y, en algunos casos, puede haber hiperestesia muscular y debilidad de miembros posteriores (Baneth y Weigler, 1997; Mundim et al., 2008; Guendulain et al., 2020). Los exámenes hematológicos revelan una ligera anemia no regenerativa y leucocitosis neutrofílica con desvío a la izquierda, sin embargo, en infecciones con niveles bajos de parasitemias, el leucograma puede no presentar alteraciones (Baneth et al., 2007; Scodellaro, 2015; Rossi et al., 2018; Guendulain et al., 2020). A diferencia de H. canis que produce signos clínicos leves o, que incluso puede ser diagnosticado de manera incidental en animales asintomáticos, H. americanum causa una enfermedad crónica, debilitante y severa, que con frecuencia lleva a la muerte (Vincent-Johnson et al., 1997). Los signos clínicos característicos son aumento de temperatura, pérdida de peso, caquexia, depresión, atrofia y debilidad muscular, dolor generalizado, descarga ocular y renuencia al movimiento. Puede haber alteraciones en la marcha, desde rigidez, paresia y ataxia de miembros posteriores, hasta recumbencia (Vincent-Johnson et al., 1997; Panciera et al., 2000; Ewing y Panciera, 2003). A diferencia de la infección por H. canis, H. americanum produce una leucocitosis marcada (Vincent-Johnson et al., 1997).

El diagnóstico de H. canis se realiza mediante la observación de los gamontes en los leucocitos (neutrófilos y monocitos) en frotis de sangre coloreados. En la hepatozoonosis americana la parasitemia en general no supera el 0,1% de los leucocitos circulantes, por lo que raramente se encuentran gamontes en los extendidos de sangre, y el diagnóstico se realiza fundamentalmente por la identificación del parásito en el músculo esquelético mediante histopatología (Ewing y Panciera, 2003). Si bien la PCR es otra de las técnicas de utilidad para realizar el diagnóstico, esta se emplea casi exclusivamente en instituciones académicas cuando se pretende determinar la especie, ya que tiene un mayor costo de realización y porque, ante la sospecha de H. canis, es muy fácil obtener el diagnóstico a través de la observación de los gamontes en sangre (Inokuma et al., 2002).

En el año 1999 se comunicó el primer caso de hepatozoonosis diagnosticado en Argentina (Silva et al., 1999), y en el año 2007 se reportó la primera caracterización molecular mediante la amplificación y secuenciación de un fragmento de 650 pares de bases del gen 18S rRNA, que mostró fragmentos 99% idénticos a Hepatozoon canis (Eiras et al., 2007). Seguidamente se fueron comunicando hallazgos en diferentes zonas del país, en la mayoría de los casos a través de la observación de gamontes en frotis sanguíneos mediante microscopía óptica (Pérez Tort et al., 2007; Esarte et al., 2010; Aubert et al., 2011; Linares, 2011; Adagio et al., 2014.; Guendulain et al., 2015; Aráoz et al., 2016; Fader et al., 2018; Rossi et al., 2018). En el año 2002, en el laboratorio de Análisis Clínicos de la Facultad de Agronomía y Veterinaria de la Universidad Nacional de Río Cuarto, se realizó por primera vez el diagnóstico microscópico de Hepatozoon spp., pero el hallazgo no fue publicado.

En la provincia de Córdoba no se ha comunicado la determinación de las especies encontradas mediante técnicas moleculares, con la excepción de dos reportes realizados en los años 2018 y 2019 por los autores de este trabajo en reuniones científicas (Guendulain et al., 2018; Debeljuh et al., 2019). En un estudio realizado en el año 2017 donde se analizaron por PCR muestras de sangre de perros de diferentes regiones del país, incluida Córdoba, en búsqueda de H. canis, no se hallaron positivos. Por ello, el objetivo de este trabajo fue confirmar la presencia y determinar la especie de Hepatozoon mediante PCR en sangre de perros diagnosticados a través de la visualización microscópica de gamontes de Hepatozoon spp. y describir los signos clínicos y resultados de laboratorio encontrados en esta región del país.

MATERIALES y MÉTODOS

Se realizó un estudio dirigido en el cual se incluyeron 64 caninos que asistieron al Hospital Escuela de la FAV por diferentes motivos y signología clínica, y que resultaron positivos en el frotis de sangre a la presencia de estructuras compatibles con Hepatozoon spp. A todos estos perros se les extrajo 5 ml de sangre de la vena cefálica antebraquial, que fue colectada en tubos con anticoagulante (EDTA), con la que se realizó hemograma y a una alícuota, se le extrajo el ADN utilizando un kit comercial (ADN puriprep S kit, Inbiohighway, Argentina) para su posterior análisis por PCR. Para la amplificación parcial del gen ARN 18S se usaron cebadores género específicos: sentido HEP-1= CGCGCAAATTACCCAATT; contrasentido HEP4= TAAGGTGCTGAAGGAGTCGTTTAT, para producir fragmentos de 666 pb (Inokuma et al., 2002). Los productos de las PCR fueron purificados, cuantificados y secuenciados (INTA Castelar). Las secuencias obtenidas fueron editadas mediante el software BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999), alineadas con el programa Clustal W (Larkin et al., 2007) y comparadas con secuencias depositadas en GenBank.

Este trabajo fue realizado de acuerdo con las normas internacionales del Consejo Internacional de Organizaciones de las Ciencias Médicas (CIOMS).

RESULTADOS

El 96,9% (62/64) de las muestras resultaron positivas en la PCR específica de género y el alineamiento de las secuencias obtenidas mostró una similitud del 99 al 100% con secuencias pertenecientes a H. canis.

La mayoría de los perros (55,6%) que resultaron positivos a la presencia de gamontes de Hepatozoon spp. presentaban signos clínicos, pero en otros (44,4%) el diagnóstico se hizo en forma accidental. Los signos clínicos fueron muy variados, destacándose el aumento de temperatura, mucosas pálidas, adenomegalia y secreción ocular. Otros signos encontrados menos frecuentemente fueron diarrea, debilidad de miembros posteriores, debilidad generalizada, postración, rigidez muscular, dolor abdominal y dolor articular digital (Figura 1).

En cuanto a los resultados hematológicos, el 70,3% (45/64) de los perros tuvo anemia, siendo más frecuente la anemia normocítica normocrómica. En el 36% (23/64) de los casos hubo leucocitosis, en el 59,3% (38/64) el valor de leucocitos se encontró dentro del rango de referencia y en el 4,7% (3/64) hubo leucopenia. El 23,4% (15/64) de los perros tuvo eosinofilia, 23,4% (15/64) eosinopenia y en 51,6% (33/64) los eosinófilos tuvieron recuento normal. Del total de perros parasitados el 48,4% (31/64) tenían garrapatas.

Figura 1
Signos clínicos presentes en los perros infectados con Hepatozoon spp.

DISCUSIÓN

Debido a que la garrapata que actúa como vector de H. americanum no ha sido encontrada hasta el momento en nuestro país, y que en los diferentes lugares del mismo donde se ha realizado el diagnóstico molecular, la especie encontrada ha sido H. canis, era de esperar que H. americanum no fuera la que habitara en nuestra región. Sin embargo, en muchos de los casos reportados en este trabajo se han observado signos clínicos semejantes a los producidos por H. americanum, como la hiperestesia muscular, paraparesia y paraplejía que, si bien han sido descriptos en casos de infección por H. canis, son más frecuentes en infecciones por H. americanum (Murata et al., 1991; Gondim et al., 1998; Gavazza et al., 2003; Mundim et al., 2008). Los signos clínicos que se presentaron con mayor frecuencia, como el aumento de temperatura, mucosas pálidas, adenomegalia y secreción ocular, fueron coincidentes con la bibliografía (Gavazza et al., 2003; Paludo et al., 2003). Otros signos encontrados menos frecuentemente como la diarrea, ataxia, debilidad de miembros posteriores, postración, rigidez muscular, dolor abdominal y dolor articular digital también fueron comunicados por distintos autores (Mundim et al., 2008; Bitton et al., 2012; Iveli et al., 2015). No se encontraron en este estudio otros signos reportados en la bibliografía tales como rinitis, vómitos, poliuria, polidipsia, ictericia ni alteraciones respiratorias y pulmonares (Gondim et al., 1998; Mundim et al., 2008).

En la infección con H. canis, la bibliografía reporta un cuadro clínico más leve que el producido por la infección con H. americanum. En esta última, al ser afectados el músculo esquelético y cardíaco por los quistes merogónicos, y al producirse lesiones proliferativas periósticas, suele haber dolor generalizado, atrofia muscular, debilidad, postración, recumbencia con imposibilidad de caminar y fiebre (Potter y Macintire, 2010). En el caso de H. canis, a pesar de que afecta al tejido hemolinfático y no al muscular, en Brasil se reportaron unos pocos casos con afección muscular, en los cuales en el estudio histopatológico de las biopsias se encontraron alteraciones similares a las provocadas por H. americanum, pero no se observaron estructuras quísticas producidas típicamente por esta especie. En India, Japón, Italia e Israel se comunicaron casos aislados de infección con H. canis con reacción perióstica y dolor óseo, similar a lo que ocurre con H. americanum (Murata et al., 1991; Priya et al., 2004; Marchetti et al, 2009). En Argentina se reportó un caso con claudicación y dolor a la palpación de un miembro como signos clínicos principales, con una lesión osteolítica que comprometía la zona cortical en proximal del húmero y zonas de reacción perióstica en el radio (Esarte et al., 2010); y otro con poliartritis con el hallazgo de merontes en la cápsula articular (Iveli et al., 2015). Probablemente, como lo sugiere Paludo et al. (2003), una misma especie o distintas cepas de una misma especie puedan producir diferentes presentaciones clínicas.

En cuanto a la hematología, la anemia normocítica normocrómica fue la presentación más frecuente en coincidencia con la bibliografía (Gavazza et al., 2003; Mundim et al., 2008; Scodellaro, 2015), a diferencia de un estudio previo presentado por los autores de este trabajo, en el cual la anemia macrocítica normocrómica fue la predominante (Guendulain et al., 2020). Martin et al., (2022) sin embargo, tuvieron este hallazgo solo en el 20% de los caninos muestreados. En la mayoría de los casos los leucocitos totales se mantuvieron dentro de los valores de referencia, tal como ocurre en los casos de baja parasitemia según la bibliografía (Gondim et al., 1998; O’Dwyer et al., 2006; Mundim et al., 2008; Scodellaro, 2015), Palomeque (2019), en cambio, encontraron leucocitosis en más de la mitad de los casos. Hubo diferencia de lo reportado por Martin et al. (2022), quienes encontraron eosinofilia en un 80% de los casos, mientras que en este trabajo solo en un 23%.

El 48,4% de los perros tenían garrapatas, por lo que, la hepatozoonosis debe ser considerada en el diagnóstico diferencial, aún en ausencia de estos ectoparásitos. En el 44,4% de los casos la parasitosis fue un hallazgo fortuito, y el diagnóstico se hizo en forma accidental en el control prequirúrgico o durante el seguimiento de algún tratamiento, lo cual coincide con lo comunicado por otros autores, quienes afirman que la infección puede ser asintomática y el parásito encontrarse en animales sanos o que padecen otra enfermedad (Baneth y Weigler, 1997; Baneth et al., 2007).

El resultado de la PCR y la secuenciación genética confirmaron la presencia exclusiva en los perros de este trabajo de H. canis. En Argentina, Eiras et al. (2007) comunicaron que sus hallazgos fueron similares en un 99% a las secuencias de H. canis disponibles en el GenBank, mientras que Aráoz et al. (2016) refieren que las secuencias obtenidas permitieron determinar su hallazgo como H. canis, pero no mencionan el porcentaje de identidad. Por otra parte, la secuencia del fragmento de ARNr 18S de H. canis encontrada por Cicuttin y De Salvo (2017) fue idéntica a secuencias de distintas regiones del mundo, y similar a otras de países sudamericanos como Venezuela y Brasil.

CONCLUSIÓN

En este trabajo el resultado de la PCR y la secuenciación genética confirmaron la presencia exclusiva de H. canis en los perros estudiados. Los signos clínicos más frecuentemente encontrados fueron aumento de temperatura, mucosas pálidas, adenomegalia y secreción ocular, y en cuanto a los resultados hematológicos, la anemia normocítica normocrómica fue la presentación más frecuente y en la mayoría de los casos los leucocitos totales se mantuvieron dentro de los valores de referencia.

Agradecimientos

Este estudio recibió financiamiento de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la UNRC.

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Notas de autor

cguendulain@ayv.unrc.edu.ar

Información adicional

Comité de Ética: Este trabajo cuenta con la aprobación del Comité de Ética de la UNRC, en el marco de los Programas y Proyectos de Investigación (Res. Rectoral N° 161/16-1038/18 ), según consta en el acta N° 88 del 21 de abril de 2016, Expte. N° 158/16.