Determinación de bombesina en estómago de cerdos con diagnóstico de gastritis provocadas por Helicobacter spp.
Lucía Belén Machuca1, María Agustina De Benedetti1, María Paula Van Deer Veen1, María Carolina Grosso1, Sabrina Giménez1, Facundo Bonino3, Virginia Mac Loughlin1.
1- Catedra de Histología, Departamento Anatomía Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.
2- Bioestadística, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.
RESUMEN. El objetivo del estudio fue analizar la relación entre Helicobacter spp y la funcionalidad de las células productoras de bombesina en biopsias gástricas de cerdos. Se determinó la presencia de Helicobacter spp en muestras gástricas de región antro-pilórica de cerdos mestizos. Fueron coloreadas con Hematoxilina/Eosina para el diagnóstico de gastritis, observándose mayor proporción de lesiones crónicas que agudas. La presencia de Helicobacter se realizó mediante tinción Giemsa y Warthin-Starry, determinándose la presencia de al menos dos especies colonizando el estómago del cerdo: una de mayor tamaño, intensamente espiralada (Helicobacter heilmannii) y otra de menor tamaño, con forma de “s” itálica (Helicobacter pylori). Mediante inmunohistoquímica se localizó Helicobacter spp en el epitelio, fosetas y glándulas gástricas. La detección de células productoras de bombesina se realizó por técnicas inmunohistoquímicas y se determinó su porcentaje en muestras con gastritis agudas y crónicas, Helicobacter (+) / (-). Las células bombesina (+) se localizaron en el epitelio glandular, tejido conectivo subyacente y tejido muscular. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos: Gastritis Crónica Helicobacter (+) / Gastritis Aguda Helicobacter (+) (p=0,04); Gastritis Crónica Helicobacter (+) / Mucosa Normal (p=0,02) y en Gastritis Crónica Helicobacter (-) / Mucosa Normal (p=0,005). El grupo con mayor número de células bombesina positivas fue el de Gastritis Aguda Helicobacter (+) cuya morfología celular fue de tipo cerrada.
Palabras clave
cerdos
gastritis
bombesina
Helicobacter
Bombesin determination in pig’s stomach with gastritis diagnose caused by Helicobacter spp.
The objective of this study was to analyze the relationship between Helicobacter spp and the functionality of bombesin-producing cells in gastric biopsies of pigs. The presence of Helicobacter spp was determined in gastric samples from the antro-pyloric region of mixed-breed pigs. They were colored with Hematoxylin/Eosin for the diagnosis of gastritis, finding a higher proportion of chronic than acute lesions. The presence of Helicobacter was carried out by means of Giemsa and Warthin-Starry staining, determining the presence of, at least, two species colonizing the stomach of the pig: one of larger size, intensely spiral Helicobacter heilmannii); and another of smaller size, in the form of “s” italic (Helicobacter pylori). Helicobacter spp was localized in the epithelium, fossa and gastric glands by immunohistochemistry. The detection of bombesin producing cells was performed by immunohistochemical techniques and its percentage was determined in samples with acute and chronic gastritis, Helicobacter (+) / (-). These cells were in the glandular epithelium, underlying connective tissue and muscle tissue. Statistically significant difference was observed between the groups: Chronic Gastritis Helicobacter (+) / Acute Gastritis Helicobacter (+) (p = 0.04); Chronic Gastritis Helicobacter (+) / Normal Mucosa (p = 0.02) and in Chronic Gastritis Helicobacter (-) / Normal Mucosa (p = 0.005). The group with the highest number of bombesin positive cells was that of Gastritis Acute Helicobacter (+), whose cell morphology was closed type.
Key words
pigs
gastritis
bombesin
Helicobacter
INTRODUCCIÓN
Helicobacter pylori es el principal agente bacteriano implicado en lesiones gastroduodenales inflamatorias en humanos, tales como gastritis crónica, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y linfomas del tejido linfoide asociado a la mucosa, siendo una de las bacterias patógenas más comunes, con una alta prevalencia a nivel mundial (Atherton y Blaser, 2009).
Este microorganismo Gram negativo, fue observado por primera vez por el patólogo Robin Warren a principios de junio de 1979. Su detección en estudios histopatológicos continuó por un par de años asociando la presencia del microorganismo con enfermedades gástricas en el hombre, efectuándose varios intentos con fines de aislar la bacteria que no lograron prosperar (Tytgort, 1994; Mc Coll et al., 1997; Warren et al., 1997; Morales et al., 2008). En 1994, H. pylori fue declarado como la principal causa de úlcera péptica y como agente cancerígeno en humano, tal como lo demuestran estudios efectuados sobre el particular (Moreno, 2005). En la actualidad algunos autores sugieren que tanto la gastritis como la úlcera péptica son patologías multifactoriales donde H. pylori no desempeñaría necesariamente un papel relevante en la misma. Si bien es sabido que H. pylori está involucrado en enfermedades gástricas de humanos, se ha determinado también la existencia de otras especies de Helicobacter que afectarían a diversos animales, tales como H. mustelae en hurones, H. acynonyx en leopardos y chitas, H. felis, H. heilmannii, H. bizzozeronii, H. salomonis, H. cynogastricus, Flexispira rapini y H. bilis en perros, H. helmannii, H. felis, H. bizzozeronii y H. pylori en gatos (Gómez et al., 2006; Odriozola, 2011). Por lo que, el Helicobacter, cualquiera sea su especie, es un factor exógeno que podría contribuir a la profundización y perpetuación del cuadro clínico (Hobsley et al., 2008; Valdivia Roldán, 2011; Vikram et al., 2013).
En porcinos se ha logrado reproducir úlcera gástrica mediante la inoculación experimental con H. pylori (Rodríguez et al., 2009); además, se ha detectado otra bacteria espiralada, ureasa positiva, que se presenta de manera natural en el cerdo, asociada también a la presentación de úlceras gastroesofágicas, razón por la cual se la propuso como un factor posiblemente relacionado con su etiopatogénesis (Queiroz et al., 1996; Rodríguez et al., 2009). Anteriormente, a este microorganismo se lo podía identificar como H. heilmannii o H. suis, los cuales son considerados como la misma especie (Goodwin et al., 1989; Barbosa et al., 1995; Rodriguez et al., 2009). En la actualidad, se ha determinado que el H. heilmannii puede subclasificarse como H. heilmannii tipo I y H. heilmannii tipo II. El subtipo I está representado por una sola especie, el H. suis, que coloniza el estómago del cerdo; mientras que, el subtipo II, abarca a todas aquellas bacterias conocidas que colonizan la mucosa gástrica tanto de perros como de gatos, incluyendo a H. felis, H. bizzozeronii, H. salomonis, H. cynogastricus, H. baculiformis y, una bacteria que desde 2004 ha recibido el nombre provisorio de Candidatus H. heilmannii, basado en el análisis de la secuencia genómica de la enzima ureasa y a su dificultad para aislarla in vitro(Baele et al. 2006; Smet et al., 2012; Bento-Miranda, 2014). Una vez logrado su aislamientoin vitro, se reconoció formalmente al H. heilmannii como una especie válida (Bento-Miranda, 2014). Más recientemente, se propuso utilizar la terminología H. heilmannii sensu lato para denominar a cualquier bacteria del género Helicobacter que no haya sido identificada como H. pylori y, la denominación H. heilmannii sensu stricto cuando el microorganismo haya sido identificado con su respectivos género y especie (Haesebrouck et al., 2011; Bento-Miranda, 2014).
La evaluación histológica en muestras gástricas de cerdo con la coloración de Warthin-Starry, reveló la presencia de dos tipos morfológicos de bacterias: la primera, caracterizada por su mayor tamaño y morfología intensamente espiralada, concuerda con las descripciones de H. heilmannii y, la segunda, de menor tamaño y con forma de “s” itálica, se corresponde morfológicamente con la bacteria H. pylori (Mac Loughlin, 2014, Mac Loughlin et al., 2015). Algunas investigaciones sugieren que estos microorganismos colonizan el estómago del cerdo o que un mismo género podría asumir patrones morfológicos diferentes por causas inherentes al ambiente gástrico del huésped (Makinde et al., 1990; Fox et al., 1997; Rodríguez, 2009).
El Helicobacter provoca alteraciones en las células de la mucosa gástrica, afectando la producción de hormonas gastrointestinales, lo que conlleva a la aparición de gastritis. Existen dos teorías que permitirían explicar la patogenia de esta enfermedad, una de ellas postula que los altos niveles de amonio producidos por la enzima ureasa interferiría con la retroalimentación negativa de la gastrina sobre las células parietales; por otro lado, la segunda teoría describe que, debido a los cambios inflamatorios inducidos por la bacteria en el tejido gástrico, se alteraría la función normal de la secreción ácida (Levi et al., 1989).
Dada la falta de estudios relacionados con la producción de bombesina en cerdos afectados por gastritis, y siendo que existen estudios efectuados en otras especies, también infectadas por dicho agente causal, que han revelado alteraciones en células productoras de bombesina, es de esperarse un comportamiento similar en cerdos que padecen gastritis. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar el comportamiento de la hormona gastrointestinal bombesina en estómago de cerdos afectados por gastritis provocadas por Helicobacter spp.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se emplearon muestras de estómago de 60 cerdos mestizos de diferentes edades y sexos, provenientes de frigoríficos de la zona de Río Cuarto, Argentina, considerados libres de enfermedad de acuerdo al examen clínico y postmortem realizado. Se procesaron 60 biopsias gástricas de la región antral que fueron lavadas con solución salina de Hank’s (SSH) (Gibco) y fijadas en formol tamponado al 10%. Una vez fijadas fueron sometidas a la técnica histológica convencional; se deshidrataron con baterías de alcoholes de graduación creciente, y se incluyeron en parafina. Se realizaron cortes histológicos de aproximadamente 4 μm. Parte de los cortes fueron teñidos con hematoxilina-eosina para el diagnóstico de gastritis, y con Giemsa y Warthin-Starry para la detección de Helicobacter spp. El resto de los cortes se sometieron a estudios inmunohistoquímicos para la identificación de Helicobacter spp. y células productoras de bombesina utilizando anticuerpos comerciales. Para ello se aplicó la técnica indirecta denominada Complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa (ABC) (Paz, 2000; Vissio, 2000; Gimeno et al., 1997). Los marcadores utilizados fueron anticuerpos primarios comerciales (anti-Helicobacter pylori 215A76 Cell Marque Corporation, USA y anti bombesina) mientras que, como reveladores, el Complejo universal avidina-biotina (ABC) y el sustrato peroxidasa diaminobencidina (DAB).
Una vez realizados los diagnósticos histopatológicos se procedió a dividir las muestras en los siguientes grupos:
Grupo A: Gastritis Agudas con presencia de Helicobacter spp
Grupo B: Gastritis Agudas sin presencia de Helicobacter spp.
Grupo C: Gastritis Crónicas con presencia de Helicobacter spp.
Grupo D: Gastritis Crónicas sin presencia de Helicobacter spp.
Grupo E: Mucosa normal
La obtención de microfotografías se realizó mediante una cámara digital Carl Zeiss AxioCam ERc 5s adosada al microscopio óptico.
De esas muestras se procedió a identificar las células productoras de bombesina para observar sus características morfológicas, ubicación y contaje de estas. Para el recuento celular se observó en cada preparación histológica, 5 (cinco) campos al azar con el fin de obtener el porcentaje de células positivas a bombesina. Se recurrió al conteo a ojo de por lo menos dos investigadores. Una vez realizado el contaje de células positivas a bombesina, los resultados fueron sometidos estadísticamente a una Prueba T para muestras independientes utilizando el programa estadístico InfoStat versión 2011 (Di Rienzo et. al., 2011).
Este trabajo cuenta con el aval del Comité de Ética de la UNRC. PPI Resolución Rectoral Nº 161/16 y 991/17.
RESULTADOS
Las muestras gástricas fueron sometidas a tinciones de Hematoxilina-Eosina y Giemsa, lo que permitió analizar las características estructurales de la mucosa gástrica y la presencia de Helicobacter spp. Se tomaron como controles negativos muestras con mucosa normal. La tinción de Giemsa nos permitió observar la presencia de estructuras, espiraladas, que se corresponden con lo descripto para Helicobacter spp., las cuales fueron confirmadas mediante las técnicas de Warthin-Starry e inmunohistoquímica.
En la figura 1 a) se puede observar una imagen microscópica de una biopsia gástrica con las características correspondientes a una mucosa normal, en la misma podemos observar un epitelio cilíndrico simple, en la lámina propia encontramos tejido conectivo laxo con glándulas gástricas. La figura 1 b) corresponde a una microfotografía de mucosa gástrica de la región antral con diagnóstico de gastritis aguda, la misma presenta una infiltración leucocitaria preferentemente polimorfonuclear en la lámina propia.
La figura 1 c) corresponde a una muestra gástrica región antral con diagnóstico de gastritis crónica.
En la figura 1 d) observamos a una microfotografía de mucosa gástrica de la región antral coloreada con tinción Giemsa en la cual podemos observar la presencia de bacilos espiralados correspondientes a Helicobacter spp., mientras que en la Figura 1 e) observamos la inmunomarcación de Helicobacter spp en una muestra gástrica región antral.
La Figura 1 f) se corresponde a una imagen de microscopía óptica de biopsia gástrica, también de la región antral, coloreada con la tinción de Warthin-Starry en la que se evidencian microorganismos correspondientes a Helicobacter spp, tanto en el epitelio superficial como en fosetasgastricas y glándulas gástricas.
La figura 1 g) corresponde a una muestra de mucosa gástrica (región antral) con diagnóstico de gastritis aguda Helicobacter (+), en la que se observa, una célula con inmunomarcación positiva para bombesina. La Fig 1 h) corresponde a una muestra de mucosa gástrica (región antral) con gastritis crónica Helicobacter (+), donde se observa la inmunomarcación positiva para bombesina de células en el epitelio glandular.
En cuanto al estudio cualitativo de las células productoras de bombesina, se determinó que, en las muestras gástricas observadas, se encontraron los dos tipos celulares: cerradas y abiertas. En las muestras con gastritis agudas, las más abundantes fueron las células cerradas; mientras que, en las muestras con gastritis crónicas, las células más abundantes fueron de tipo abierta. Morfológicamente, las células abiertas presentan una forma triangular y su borde apical alcanza la luz de las glándulas. Por otro lado, las células cerradas presentan una forma más redondeada y se observan cerca de la membrana basal, sin llegar a la luz glandular. La distribución de los gránulos en las células con inmunomarcación positiva mostró cierta variación, ya que los mismos no solo se ubicaron en la parte basal de la célula, sino también en otras áreas de la superficie celular. Algunos manifestaron aspecto grueso e intensamente teñidos, mientras que otros fueron más finos y débilmente teñidos. En algunas células, dichos gránulos no evidenciaron diferencia alguna entre sí, mostrando una apariencia homogénea; mientras que en otras, la presencia de gránulos fue escasa.
Al evaluar el porcentaje de células bombesina positivas en los grupos A y B se observó que no existen diferencias significativas (p= 0,07). A su vez, en aquellas muestras pertenecientes a los grupos C y D, tampoco se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas (p= 0,87).
Por otro lado, al comparar biopsias con gastritis agudas y crónicas, Helicobacter positivas, correspondientes al grupo A y grupo C respectivamente, los resultados nos confirman que en estos grupos si existen diferencias estadísticamente significativas (p= 0,04). Al evaluar los porcentajes de células bombesina positivas en muestras de gastritis agudas y gastritis crónicas, Helicobacter negativas, pertenecientes a los grupos B y D respectivamente, la Prueba T determinó que para este tipo de muestras no existen diferencias estadísticamente significativas (p= 0,17).
Además, al comparar muestras correspondientes al grupo A respecto a las muestras del grupo E, se observó que en el porcentaje de células positivas a bombesina, no existían diferencias estadísticamente significativas (p=0,11). Sin embargo, los resultados del análisis de las células productoras de bombesina en muestras del grupo C respecto a las muestras del grupo E, mostraron que sí existen evidencias significativas (p= 0,02).
Asimismo, los resultados estadísticos entre muestras pertenecientes al grupo D respecto a las pertenecientes al grupo E demuestran que en el porcentaje de células positivas a bombesina existen diferencias estadísticamente significativas (p= 0,005).
Tabla 1. Analisis estadisticos: Prueba t % de células productoras de bombesina en muestras gástricas de cerdos.
Por último, en relación a los resultados estadísticos de las muestras correspondientes al grupo B respecto a las muestras del grupo E, se observó que no existen evidencias estadísticamente significativas (p= 0,5). (Tabla 1).
Al analizar el promedio de células productoras de bombesina en cada grupo, con su correspondiente desvío estándar, podemos determinar que el grupo con mayor número de células bombesina positivas se corresponde con las gastritis agudas con presencia de Helicobacter. Por otro lado, los grupos de gastritis crónicas con y sin presencia de Helicobacter fueron aquellos en los que se registraron los porcentajes más bajos (Fig. 2).
Fig 2. Análisis de los promedios de las células bombesina positivas. Los valores se expresan como el promedio ± SEM (* p≤0,05)
DISCUSIÓN
En este estudio pudimos determinar que los resultados histopatológicos son coincidentes con los hallados por otros investigadores dado que se logró determinar la presencia de un infiltrado leucocitario y lesiones compatibles con gastritis aguda y crónica. Dichas lesiones se corroboraron a través de tinciones histológicas convencionales.
Mediante las tinciones histológicas Giemsa y Warthin-Starry se determinó la presencia de bacterias espiraladas que concuerdan con las descripciones de Helicobacter spp. Al igual que otros autores, fue de gran utilidad la realización de una técnica sencilla, la tinción Giemsa, que permite la visualización de este patógeno (Delgado et al., 2007). Mediante la segunda técnica se logró identificar al menos dos tipos de Helicobacter; uno de mayor tamaño e intensamente espiralado y otro de tamaño inferior y con forma de S itálica, que se corresponden con H. heilmannii y H pylori respectivamente, coincidiendo con diversos autores que describen a estas dos especies como patógenos frecuentes del cerdo al igual que H. felis (Goodwin et al., 1989; Rodriguez et al. 2009; Mac Loughlin et al, 2016).
A través de la técnica de inmunohistoquímica realizamos la inmunodetección de microorganismos correspondientes al género Helicobacter en todas las biopsias gástricas estudiadas. Dicha técnica no puede ser utilizada de rutina para el diagnóstico de este agente debido a los altos costos, tiempo de realización y la necesidad de contar con personal debidamente especializado. En concordancia con Mac Loughlin, 2014, la inmunolocalización de Helicobacter fue en el epitelio, en el interior de las fosetas gástricas y en relación a las glándulas gástricas.
En este estudio se estableció que existen diferencias estadísticamente significativas en relación a la gastritis crónica. Siendo que la región estudiada se corresponde a la región antropilórica, creemos que podría verse afectada en el curso crónico de la enfermedad. Esto se contrapone con la investigación realizada por otros autores en la que encontraron que en la fase crónica de la enfermedad el sitio de colonización más frecuente era la región fúndica (De Witte et al., 2017).
Estudios realizados en diversos modelos animales demostraron que la bombesina a nivel central puede tener un efecto inhibitorio de la secreción ácida, al igual que cuando es suministrada de forma exógena a dosis altas (Gutierrez, 1988, Piqueras Ruiz, 2004). Sin embargo, mediante estimulación vagal e infusión de dicho péptido, se produciría un aumento en la secreción de ácido clorhídrico, que se explicaría mediante el aumento de gastrina (Gutierrez, 1988). Otros autores han determinado que la acción inflamatoria del Helicobacter sobre la mucosa gástrica produce una disminución de las células D productoras de somatostatina, hormona encargada de inhibir la secreción de ácido clorhídrico (Mac Loughlin et al., 2016). De esta manera, el estímulo de la bombesina sobre las células G productoras de gastrina se haría más evidente ya que estas han perdido su control inhibitorio. Esto concuerda con nuestras investigaciones ya que se observó un aumento del número de células productoras de bombesina en las muestras con gastritis crónica donde la función gástrica se encuentra totalmente alterada.
La hipergastrinemia asociada con H. pylori es producida por la acción de la bombesina ya que, una vez erradicada la bacteria, los niveles de la hormona vuelven a su normalidad lo cual explicaría la importancia de la bombesina en la infección causada por esta bacteria (Graham et. al, 1991; Piñol Jiménez y Paniagua Estévez, 2006). Asimismo, se ha comprobado que la gastrina por si misma posee efectos tróficos sobre las células parietales, por lo que un estímulo prolongado de la bombesina sobre las células G derivaría en una hiperplasia de las mismas, con el consiguiente aumento en la secreción ácida gástrica (Gutierrez, 1988).
Por otro lado, varios estudios han establecido que el H. suis asociado a ulceras estomacales en cerdos pueden ser causal de muerte súbita, un problema importante para la producción. Estas pérdidas económicas para la industria porcina y el riesgo de que las bacterias puedan infectar a seres humanos justifican la necesidad de futuras investigaciones. Los datos demuestran que los seres humanos en contacto cercano con cerdos tienen un riesgo más alto a adquirir la infección (Baele et al., 2008; Liang et al., 2013).
CONCLUSIONES
Mediante la técnica histológica convencional de Hematoxilina/Eosina se logró el diagnóstico de gastritis aguda y crónica en muestras gástricas de cerdo.
La presencia de Helicobacter spp. en estómago de cerdos indica la capacidad de este microorganismo de infectar de manera natural a esta especie.
A través de las tinciones diferenciales de Giemsa y Warthin-Starry logramos determinar la presencia de microorganismos altamente espiralados compatibles con Helicobacter spp.
Tanto las técnicas de Giemsa, Warthin Starry como la inmunolocalización de Helicobacter spp. revelaron su presencia principalmente en el epitelio, foseta gástrica y glándula gástrica. La mayor colonización por Helicobacter fue detectada en la región antral del estómago.
La técnica de inmunohistoquímica permitió la identificación de células productoras de bombesina, las cuales se localizaban en el epitelio glandular, en el tejido conectivo subyacente y en el tejido muscular.
Se observó un aumento del número de células productoras de bombesina en las muestras con gastritis crónicas positivas a Helicobacter spp., las mismas se ven afectadas por la acción de este agente causal.
No se observaron evidencias estadísticamente significativas en el número de células productoras de bombesina de las muestras de gastritis aguda con presencia y/o ausencia de Helicobacter spp.
En las muestras con gastritis aguda se determinó que la morfología celular predominante fue de tipo cerrada, mientras que, en las muestras con gastritis crónicas, se determinó que la morfología celular más abundante fue de tipo abierta.
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