Análisis morfométrico de la microvasculatura del tendón flexor digital profundo a nivel suprasesamoideo distal en equinos mestizos silleros sometidos a ejercicio

Morphometric analysis of the microvasculature in the deep digital flexor tendon at a suprasesamoidean area in equines subjected to exercise

Rafael Audap Soubie1 ; Mariana Fiorimanti2,3 ; Mario Salvi1 ; Cecilia Merkis2 ; Andrea Cristofolini2,3*

1- Departamento de Clínica Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto, Córdoba, Argentina.

2- Área de Microscopía Electrónica del Departamento de Patología Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria Universidad Nacional de Río Cuarto, Córdoba, Argentina.

3- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. CONICET. Argentina.

RESUMEN. El dolor palmar en el pie del equino es la causa más frecuente de claudicación, pudiendo involucrar al tendón flexor digital profundo (TFDP). La patogenia de la enfermedad aún no ha sido determinada, pero se han reportado evidencias de neovascularización y procesos degenerativos en la matriz vascular y fibrocartilaginosa. Es necesario profundizar el estudio de los cambios vasculares en el TFDP y establecer la relación existente entre las imágenes ecográficas con los hallazgos macroscópicos y microscópicos. Para ello se utilizaron miembros anteriores de caballos mestizos silleros provenientes de frigorífico, clasificados en dos grupos, animales no montados ni ejercitados (grupo A) y animales montados y sometidos a ejercicio (grupo B). Se tomaron muestras de tejido del lóbulo medial del TFDP y se conservaron en formol tamponado para su estudio microscópico. Parte de los cortes fueron teñidos con hematoxilina/eosina para el análisis morfohistológico del tejido y el resto fue destinado para la marcación específica de los endotelios vasculares por lectinohistoquímica y el análisis morfométrico del número y área de vasos y densidad vascular. Hallamos procesos de neovascularización y cambios degenerativos vasculares, en TFDP de caballos sometidos a ejercicio. La especificidad de la lectina Ulex europaeus nos permitió localizar endotelios microvasculares, especialmente en los tendones lesionados. Se determinó en equinos sometidos a ejercicio un incremento del número de capilares, del área vascular y de la densidad del número capilar. El microambiente deficitario de oxígeno generado por las alteraciones vasculares observadas, actuaría como una señal desencadenante del proceso angiogénico, originando una hipervascularización deficitaria.

PALABRAS CLAVE: neovascularización, tendinopatía, equinos, ejercicio.

ABSTRACT. Palmar pain in the equine foot is the most common cause of lameness, this may involve the deep digital flexor tendón (DDFT). The pathogenesis of the disease has not been determined yet, but evidence of neovascularization and degenerative processes in the vascular and fibrocartilaginous mathrix have been reported. It is necessary to deepen the study of vascular changes in the DDFT and established the existing relationship between the ultrasound images with the macroscopic and microscopic findings. For this, fore limbs of halfblood saddle horses from slaughter house were used, they were clasificated into two groups, not ridden or exercised animals (group A), and ridden and exercised animals (group B). Samples were taken from DDFT medial lobe tissue and were stored in buffered formalin for their microscopic study. Part of the sections were stained with hematoxylin/eosin for morphohistological analysis of the tissue and the rest was destined for specific marking of vascular endothelials by lectinohistochemistry and the morphometric analysis of the number and area of vessels and vascular density. We found neovascularization processes and vascular degenerative changes, in DDFT of horses subjected to exercise. The specificity of the Ulex europaeus lectin allowed us to locate microvascular endotheliums, especially in injured tendons. An increase in the number of capillaries, the vascular area and the density of the capillary number was determined in equine subjected to exercise. The oxygen deficient microenvironment, generated by the observed vascular alterations, would act as a trigger signal for the angiogenic process, causing a deficient hypervascularization.

KEY WORDS: neovascularization, tendinophaty, equine, exercise.

INTRODUCCIÓN

El dolor palmar en el pie del equino es una de las causas más frecuente de claudicación de los miembros anteriores, pudiendo verse involucrado el tendón flexor digital profundo (TFDP) (Widmerd et al., 2000).

El progreso en el campo del diagnóstico por imagen, tal como la resonancia magnética y la ecografía, han demostrado que la tendinitis suprasesamoideas del TFDP es la lesión de tejidos blandos más común como causa de claudicación originada en el pie (Schramme, 2011). Las tendinopatías son lesiones comunes en los caballos de deporte y producen pérdidas económicas significativas para la industria equina.

La patogenia de la enfermedad en cuestión aún no ha sido determinada, si bien es posible, que las lesiones puedan ser producto de un trauma agudo o como resultado de un estrés repetitivo (Tempfer y Traweger, 2015). Se han reportado informes y resultados que evidencian neovascularización, procesos degenerativos en la matriz vascular (Crisan et al., 2013) y de la matriz fibrocartilaginosa en relación a la celularidad, los proteoglicanos y el colágeno de la misma (Beck et al., 2011).

Actualmente se dispone de limitada información respecto a la fisiopatología de las lesiones del TFDP en la zona digital, si bien, estudios realizados en tendones de humanos han determinado que bajo condiciones fisiológicas normales la neovascularización se suprime (Beck et al., 2011), a diferencia de las tendinopatías crónicas del tendón de Aquiles en las cuales la angiogénesis ha sido asociada a degeneración de la matriz extracelular (Petersen et al., 2004; Beck et al., 2011). Numerosos autores postulan la ocurrencia de un proceso degenerativo, debido a la falta de evidencia histológica de células inflamatorias (Busoni et al., 2005; Blunden et al., 2006; Blunden et al., 2009). Es necesario profundizar el estudio de los cambios vasculares y los mecanismos mediante los cuales se llevan a cabo las tendinopatías suprasesamoideas del TFDP. Se debe establecer la relación existente entre los cambios de la microvasculatura del tendón y su impacto en la lesión de la porción distal del TFDP. El objetivo del trabajo fue determinar los cambios vasculares que se presentan en el tendón flexor digital profundo de miembro anterior a nivel suprasesamoideo en equinos mestizos silleros sometidos a ejercicio, mediante el análisis microscópico convencional y por lectinhistoquímica para la visualización específica de la vasculatura y el estudio vascular por morfometría.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Se seleccionaron 15 caballos mestizos destinados a faena, provenientes del Frigorífico General Pico SA de Río Cuarto, Córdoba. Los animales fueron divididos en dos grupos, grupo A (5) animales que no fueron montados, entre 2 y 4 años de edad, de 350 a 450 Kg de peso y de ambos sexos; y grupo B (10) animales que habían sido montados, entre 5 y 18 años de edad, de 350 a 450 Kg y de ambos sexos.

Inmediatamente después de obtenidos los miembros anteriores y previo a su examen ecográfico, se procedió a la higienización, hidratación y rotulado de los mismos. El examen ecográfico del tendón flexor digital profundo (TFDP) y de sus estructuras adyacentes se realizó de forma transversal y longitudinal a nivel suprasesamoideo entre los bulbos de los talones sobre la fosa de Genot. En cada miembro se procedió a extraer la piel desde el borde coronario del casco hacia proximal, luego se realizó la desarticulación interfalángica distal mediante la incisión de los ligamentos colaterales medial y lateral, inmediatamente después se incidieron los ligamentos colaterales del hueso sesamoideo distal (HSD) para despejar el aparato podotroclear y por último se aisló la porción suprasesamoidea del TFDP.

Análisis macroscópico de la superficie dorsal del TFDP

Una vez obtenido el TFDP se procedió a su valoración macroscópica, previo lavado con solución fisiológica (cloruro de sodio 0,9 % P/V) para limpieza de posibles impurezas. Los hallazgos macroscópicos se registraron mediante la adquisición de fotografías digitales (Olympus, Japón).

Toma de muestras del TFDP

Se tomaron muestras de tejido mediante la técnica de biopsia con trocar de 5 mm de diámetro, en la región central del lóbulo medial del TFDP a nivel suprasesamoideo, involucrando todo el espesor del tendón. Las muestras fueron colocadas en formol tamponado al 10% y se procesaron de acuerdo a la técnica histológica convencional.

Análisis de las muestras

Técnica histológica convencional

Las muestras fijadas del TFDP se deshidrataron con batería de alcoholes de graduación creciente (3 veces por alcohol 96% y dos veces por alcohol absoluto, 15 minutos cada uno de los lavados). Luego se aclaró el tejido mediante tres pasajes por xilol, 10 minutos cada uno, y se impregnó colocándolo en parafina fundida a 51ºC durante 3 horas. El tejido fue seccionado con un micrótomo Jung RM 2065 Leica (USA), en láminas de 4 µm, las que se colocaron en agua atemperada a 50ºC para ser montadas en portaobjetos gelatinizados y luego ser secadas a temperatura ambiente. Parte de los cortes se colorearon con hematoxilina/eosina, el resto fue destinado para la técnica de lectinhistoquímica.

Localización de vasos sanguíneos a través de lectinohistoquímica

A través de la utilización de la lectina Ulex europaeus (Sigma-Aldrich®, USA) liofilizada y conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), se realizó sobre cortes histológicos de 4 µm, la técnica de lectinhistoquímica para la marcación del residuo glicosilado L-fucosa. Las secciones fueron incubadas con 75 µl de la lectina conjugada con FITC y cubriendo con parafilm “M” (Laboratory film – American National TM, USA) para lograr una disposición homogénea de la lectina sobre los cortes. Simultáneamente, se procesaron controles negativos de tendones sustituyendo la lectina conjugada por solución salina tamponada. La incubación se realizó en cámara húmeda y en oscuridad, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron lavadas con solución salina tamponada, montadas con Fluoprep (Biomerieux) y mantenidas en oscuridad hasta su inmediata observación en un microscopio de epifluorescencia.

Análisis de la estructura tisular y vascular

Las secciones coloreadas con hematoxilina-eosina fueron utilizadas para el análisis por microscopía óptica de la estructura general y vascular del tendón. Asimismo, las secciones procesadas por lectinhistoquímica fueron utilizadas para evaluar la vasculatura del tendón ya que la localización específica de células endoteliales a través de la marcación de L-fucosa permitió identificar vasos sanguíneos de daños tisulares. La observación se realizó a través de un microscopio óptico Axiophot (Carl Zeiss, Alemania) y la adquisición de imágenes con una cámara digital Powershot G6, 7.1 megapixels (Canon INC, Japón) adosada al microscopio.

Análisis morfométrico vascular

Se analizaron 2 secciones de cada muestra de tendón estudiado, se adquirieron imágenes de 5 campos al azar de cada una de ellas a una magnificación de 200x, las que fueron evaluadas mediante el software AxioVision Release 4.6.3 (Carl Zeiss, Alemania). Se realizó el conteo de número de vasos, se determinó el área vascular y se calculó la densidad de número capilar (DNC: número de capilares totales como proporción del área del tejido). Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente con el software InfoStat (Di Rienzo, et al., 2018), se realizó un ANOVA y una comparación a posteriori con el test LSD Fisher. Cuando los supuestos de normalidad y homogeneidad de los datos no se cumplían, fue utilizado un test a posteriori no paramétrico, Kruskal Wallis. Se consideró estadísticamente significativo un p≤0,05.

RESULTADOS

En el análisis macroscópico de la totalidad de los tendones pertenecientes a equinos no montados, pudo diferenciarse correctamente la separación lobar característica de dicha estructura y su alineamiento fibrilar en cada lóbulo. En todos los casos la coloración fue blanca y no se observaron hendiduras sagitales, fibrilación ni adherencias en los tendones analizados. En el corte transversal del TFDP se observó la delimitación lobar de ambos lóbulos y su arquitectura colágena normal (Figura 1).

Imagen que contiene tabla, naranja, comida, alimentos

Descripción generada automáticamente

Figura 1- A) Vista dorsal de la porción suprasesamoidea del TFDP. Color blanco con alineamiento fibrilar normal (flecha). B) Corte transversal del TFDP a nivel suprasesamoideo del MAI equino normal. Lóbulo medial (LM) y lóbulo lateral (LL).

Cinco equinos sometidos a ejercicio presentaron alteraciones macroscópicas, tanto en su aspecto superficial dorsal como en su apariencia estructural del corte transversal a nivel suprasesamoideo. Respecto a la coloración de la superficie dorsal del tendón se halló en los cinco equinos restantes cambios caracterizados por tonalidades amarillas. De los caballos que evidenciaron cambios en la coloración de la superficie dorsal, un equino presentó fibrilación de la misma superficie y otro evidenció hendiduras longitudinales y fibrilación de la superficie dorsal (Figura 2).

Foto montaje de la cara de un emparedado

Descripción generada automáticamente con confianza baja

Figura 2- Aspecto dorsal de la porción suprasesamoidea del TFDP, se observa coloración amarilla, fibrilación y hendiduras longitudinales (flecha) en la superficie dorsal a nivel suprasesamoideo y sesamoideo (A). Corte transversal del TFDP a nivel suprasesamoideo, se observan cambios en la morfología y estructura del tendón (flecha) (B). Vista dorsal de la porción suprasesamoidea del TFDP, nótese la coloración amarilla y fibrilación (flecha) en la superficie dorsal a nivel suprasesamoideo y sesamoideo (C).

En equinos mestizos no montados ni sometidos a ejercicio, la morfohistológica general del tendón se caracterizó por una disposición lineal de fascículos colágenos, tenocitos y endotendón con vasos sanguíneos. Se pudo diferenciar la superficie dorsal del tendón recubierta por fibrocartílago, escasamente vascularizado, a diferencia del aspecto palmar del tendón en el que se pudo apreciar mayor cantidad de vasos sanguíneos. En la totalidad de los caballos estudiados en este grupo, se observó una distribución vascular estrictamente interfascicular y de disposición longitudinal, conformada por arteriolas y vénulas (Figura 3).

Figura 3: Microfotografía de un corte histológico teñido con H/E del TFDP a nivel suprasesamoideo correspondiente a un equino mestizo no montado ni sometido a ejercicio, en donde se observa la disposición normal de arteriolas y vénulas (flecha) en el endotendón, entre fascículos de fibras colágenas. 200x

.

En la totalidad de los caballos montados y sometidos a ejercicio, se han observado procesos de neovascularización y cambios degenerativos vasculares. En cuatro equinos se determinaron focos de intensa neovascularización a nivel del fibrocartílago dorsal caracterizada por capilares agrupados, donde habitualmente no se observan vasos sanguíneos (Figura 4).

Figura 4: Microfotografía de un corte histológico teñido con H/E del TFDP a nivel suprasesamoideo correspondiente a un equino mestizo montado y sometido a ejercicio, en donde se observa neovascularización (flecha negra) del fibrocartílago dorsal (flecha roja). 400x.

En ocho equinos se determinó la presencia de vasos sanguíneos con diferentes grados de oclusión luminal rodeados por áreas focales de proliferación capilar, los mismos fueron hallados en la región intermedia y profunda del tendón, poniendo en evidencia procesos de neoformación vascular. En tres caballos se determinó la presencia de pérdida de la regularidad endotelial y edema sub endotelial, el que podría deberse al incremento de la permeabilidad vascular de dichos vasos. Mientras que en un solo equino se detectó la presencia de micro trombos (Figura 5).

Figura 5: Microfotografías de cortes histológicos teñido con H/E del TFDP a nivel suprasesamoideo correspondiente a equinos mestizos montados y sometidos a ejercicio, en donde se observa neovascularización y cambios degenerativos vasculares. A) Oclusión luminal (flecha negra) y neovascularización (punta de flecha). B) Micro trombo (flecha roja) e intensa neovascularización (punta de flecha). A y B: 400x.

La marcación específica del residuo glicosilado de L-fucosa presente en células endoteliales a través de la lectina Ulex europaeus nos permitió la localización y diferenciación de estructuras vasculares en tendones de ambos grupos, pudiendo así evaluar la presencia de vasos sanguíneos en zonas en donde a través de la tinción histológica diferencial no fue posible discriminarlos de otros componentes. Esta localización nos permitió determinar específicamente la ausencia de vasos sanguíneos con cambios degenerativos, diferenciándolos respecto a focos de metaplasia y necrosis de fibras colágenas en el tejido dañado (Figura 6).

Figura 6: Microfotografía de epifluorescencia del TFDP a nivel suprasesamoideo. A) Equino del grupo A en el que se observa la integridad normal del fibrocartílago dorsal (flecha) y la ausencia de vasos sanguíneos en el mismo. B) Equino correspondiente al grupo A en la que se evidencia una arteriola con su estructura normal y la marca positiva del endotelio (flecha). C) Equino del grupo B en donde se observa un intenso foco patológico de neovascularización (flechas) situado en la región intermedia del tendón. D) Equino del grupo B en el que se observa neovascularización sobre el fibrocartílago dorsal. A, C y D: 200x; B: 400x.

En muestras de TFDP de equinos montados y sometidos a ejercicio, el análisis de las variables vasculares por morfometría reveló un aumento estadísticamente significativo en el número de vasos sanguíneos, en el área vascular y en la DNC (p≤0,05) (Figuras 7, 8 y 9).

Figura 7: Análisis morfométrico del número de vasos sanguíneos en los grupos de estudio. Letras diferentes representan diferencias estadísticamente significativas (p≤0,05).

Figura 8: Análisis morfométrico del área vascular por grupos. Letras diferentes representan diferencias estadísticamente significativas (p≤0,05).

Figura 9: Determinación de densidad de número capilar (DNC) o densidad vascular. Letras diferentes representan diferencias estadísticamente significativas (p≤0,05).

DISCUSIÓN

A través del análisis ultrasonográfico de los tendones evaluados y su aspecto macroscópico (datos no publicados) hemos determinado que todos aquellos tendones ecográficamente anormales y de aspecto macroscópico alterado, han sufrido cambios en la microvasculatura del fibrocartílago dorsal, en concordancia con lo descripto por Crisan et al. (2013). Incluso en aquellos equinos sometidos a ejercicio en los que no se evidenciaron cambios ultrasonográficos, se presentaron alteraciones vasculares significativas que precedieron a la evidencia ecográfica de las lesiones. Estos hallazgos presentan información relevante a considerar en el proceso de interpretación clínica de caballos con dolor crónico del pie.

Hemos determinado en muestras de TFDP de equinos no sometidos a ejercicio, una distribución vascular estrictamente interfascicular y de disposición longitudinal en concordancia con lo descripto por otros autores (Beck et al., 2011; Crisan et al., 2013).

Los procesos de neovascularización y cambios degenerativos vasculares, observados en los caballos sometidos a ejercicio, coinciden con lo documentado por Blunden et al. (2006, 2009). Si bien la relación entre el ejercicio físico y las tendinopatías respecto a los cambios vasculares han sido ampliamente estudiadas en humanos, no se ha estudiado profundamente la respuesta vascular en tendones de animales deportivos y si dicha respuesta responde a las demandas necesarias para los procesos de reparación de sus lesiones. Nuestros hallazgos permiten determinar una alteración vascular en el tendón flexor digital profundo de equinos montados y sometidos a ejercicio, caracterizada por la presencia de importantes cambios vasculares degenerativos en vasos de mayor calibre, acompañado de áreas de proliferación capilar.

Los procesos de neovascularización que hemos observado en el fibrocartílago dorsal en los caballos sometidos a ejercicio, coinciden con lo descripto por Schrame (2011), quienes postulan que ocurren como consecuencia del estrés biomecánico de dicha región en contacto con las superficies óseas adyacentes tales como el aspecto palmar del hueso sesamoideo distal.

Hemos sido los primeros en documentar la utilización de la lectina Ulex europaeus como marcadora de endotelios vasculares en tendones. La especificidad de la misma nos ha permitido la localización endotelial microvascular en tendones de equinos de ambas categorías estudiadas, siendo determinante su utilización para discriminar aquellos nuevos vasos sanguíneos en áreas con intensos daños tisulares. Dicha técnica representa una herramienta específica para diferenciar cambios estructurales de fibras colágenas tales como, focos de fibroplasia respecto a capilares con degeneración estructural y oclusión luminal.

El TFDP de equinos sometidos a ejercicio presentó un aumento significativo tanto en el número de vasos sanguíneos como en el área vascular de los mismos. Asimismo la densidad del número capilar se vio incrementada, afectada tanto por el número de vasos generados en el tejido lesionado, como por el aumento de su tamaño, determinándose una significativa proliferación microvascular en zonas de tejido lesionado y con intensa degeneración.

Tal como lo plantea Riggin et al. (2020), la respuesta de neoformación de vasos sanguíneos en tendones lesionados sería necesaria para la curación del tejido, sin embargo, una hipervascularización prolongada inducida por un desequilibrio entre factores intervinientes, resultaría en una respuesta angiogénica deficitaria. Nuestros hallazgos demuestran que en la porción distal del tendón flexor digital profundo de equinos, la lesión inducida por el ejercicio origina una respuesta angiogénica con aparición de neocapilares estructuralmente deficitarios que afectaría la curación del tendón. Si bien se han realizado estudios de tratamientos antiangiogénicos moduladores de la respuesta vascular en modelos humanos (Xiao et al., 2016) y en tendones de ratones (Tempfer et al., 2018), no se han llevado a cabo aún trabajos que prueben su eficacia en tendones y ligamentos de equinos deportivos. Consideramos que el conocimiento de los procesos angiogénicos y de aquellas moléculas involucradas en la neovascularización deficitaria que ocurre durante la reparación de tendones lesionados es fundamental, debido al potencial clínico de futuros tratamientos en base a la administración de factores que favorezcan el aporte sanguíneo necesario a través de capilares morfológicamente normales y funcionales.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la contribución desinteresada del Frigorífico General Pico SA (Río Cuarto, Córdoba) por proveer las muestras necesarias de equinos destinados a faena.

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Financiamiento: PPI, SeCyT, UNRC.

*Autora para correspondencia: Andrea Cristofolini Ruta Nacional 36, Km. 601, Código Postal X5804BYA Río Cuarto, Córdoba, Argentina; E MAIL alcristofolini@gmail.com

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Artículo recibido: 27 de febrero de 2021. Artículo aceptado: 29 de mayo de 2021

Cómo citar este artículo: Audap Soubie, R., Fiorimanti, M., Salvi,M., Merkis, C., Cristofolini, A. (2021). Análisis morfométrico de la microvasculatura del tendón flexor digital profundo a nivel suprasesamoideo distal en equinos mestizos silleros sometidos a ejercicio. Revista Ab Intus 7 (4)

ARK-CAICYT: http://id.caicyt.gov.ar/ark:/s26182734/ks73ruaae

Revista Ab Intus FAV-UNRC

2021, 7 (4): 01-09 ISSN 2618-2734